Zwei Bauarten der Fluoreszenz-Beleuchtung

1. offizieller Beitrag

    Hallo zusammen,

    Fluoreszenz kann sowohl im Auflicht als auch im Durchlicht angewandt werden.

    In Wikipedia wird aber die Durchlichtvariante nicht Mal erwähnt.
    https://de.wikipedia.org/wiki/Fluoreszenzmikroskopie

    Angeblich hat Auflicht viele Vorteile, die ich noch nicht herausgefunden habe. Muss aber zugeben, dass ich nicht besonders lange danach gesucht habe.
    Dann also ohne Vorurteile werde ich die Durchlichtvariante für mein Biolam aufbauen.

    Es gibt von LOMO einen Fluoreszenz-Beleuchter, den ich mir etwas genauer angeschaut habe.
    Das optische System der fluoreszierenden Beleuchtung ОИ-18A von LOMO besteht aus:
    1.) Lichtquelle ( Quecksilber-Quarzlampe )
    2.) Kollektor
    3.) Feldblende
    4.) Anregungsfilter ( austauschbar )
    5.) Kugelreflektor
    6.) Sperrfilter ( kommt aufs Okular )

    [Blockierte Grafik: http://i1167.photobucket.com/albums/q623/marioleczka/LOMO_Aufbau_zpsicu8ag2g.jpg]
    Der Kugelreflektor soll in die Austrittspupille des Objektivs des Mikroskops ein zweites Bild der Lichtquelle projizieren.
    Falls er nur den Lichtstrahl verstärken soll, dann könnte ich auf ihn verzichten.

    Der Strahl der FL-Beleuchtung von LOMO wird einfach auf den Spiegel des Mikroskops gerichtet. Das entspricht also der Durchlicht-Methode.
    [Blockierte Grafik: http://i1167.photobucket.com/albums/q623/marioleczka/Biolam_mit_Fluoreszenz_zps8qgtvg68.jpg]

    Wenn das also als Durchlicht funktioniert, dann kann ich doch gleich den Beleuchter ОИ-35 zur Erzeugung der Köhlerscher Beleuchtung nehmen und nur die Lichtquelle ändern.

    Dann könnte das, wie folgt funktionieren:
    http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_…urchlichtHF.htm
    Bin gespannt, ob man mit Stacking die Unschärfe von den fluoreszierenden Strukturen außerhalb der Fokusebene bei dickeren Präparaten reduzieren kann.

    Im ersten Schritt würde ich die folgenden LED‘s einbauen:
    1.) Cree-LED blau 455nm-460nm
    http://www.ebay.de/itm/3-Watt-Hig…#ht_1919wt_1333
    2.) COB-LED blau 460nm-470nm
    http://www.ebay.de/itm/10W-HIGH-P…#ht_2297wt_1333

    Welche von den beiden wäre besser geeignet, bzw. gibt es dazu eine andere Empfehlung? Welcher Wellenbereich ist für Anfänger besser geeignet, bzw. in dem man auch einfacher passende Fluorochrome finden/beschaffen kann.
    Ist jemanden von Euch die HP-LED LE1 bekannt?

    Wenn die LED‘s wirklich nur in diesem Spektrum strahlen, dann könnte ich auf den Anregungs-Filter auch verzichten.

    Ob ich einen Sperrfilter brauche, weiß ich noch nicht. Zuerst werde ich mit einem einfachen UV-Filter auf der Relaisoptik probieren. Dann noch mit PS das Anregungslicht etwas reduzieren.

    Ich hoffe, dass meine LOMO-Superobjektive keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
    Falls sie Probleme mit dem Durchlassen von UV und kurz-blau haben sollten, dann wäre das in der Durchlicht-Variante eigentlich nur von Vorteil.
    Schlimmer wäre, wenn der Kondensor nicht mitmachen würde.

    Hat dieser Plan eine Chance auf Erfolg?
    Was habe ich übersehen, nicht berücksichtigt bzw. komplett vergessen?

    Danke im Voraus für Eure Hinweise.

    Gruß,
    Adi

    • Offizieller Beitrag

    hallo Adalbert

    Du suchst dir zwar immer Leds mit hoher Leistung aus, aber verschenkst dann 2/3 des Lichts und mehr, da die LED zu groß ist, für die nachfolgende Kollektoroptik.
    Du solltest dich mit der LED Größe nach der Wendelgröße richten, die ursprünglich im Lampenhaus inne war, dann passt es sicher mit Leistung, Streulicht und optischer Abbildung.
    Ich habe hier mal LED-Datenblätter eingestellt, im Forum. Einfach suchen.


    lg
    Franz

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    Die Welt wäre so schön wenn Frauen so einfach gestrickt wie die Maxwellschen Gleichungen wären --
    Mann könnte dann Störfelder berechnen und Wellen, Phasen und Ströme ....
    und die Harmonischen ganz leicht checken..
    http://interphako.at

    • Offizieller Beitrag

    Hallo Adi,

    bei Auflicht-Fluoreszenz wird das Objekt mit dem kurzwelligen Licht an der Oberfläche bestrahlt, die man auch betrachtet und das Verfahren ist effizienter, zumal das Objektiv gleichzeitig Kondensor ist und die Intensität der Anregung auch mit der Vergrößerung des Objektives zunimmt. Bei Durchlichfluoreszenz ist diese konstant, da von der Apertur des Kondensors abhängig. Dafür läßt sich die Durchlichtfluoreszenz eben einfacher realisieren. Und du bist auf dem besten Wege dazu. ;)

    VG
    Bernd

    • Offizieller Beitrag

    Hallo Adi,

    das kommt ganz darauf an, was du machen willst. ;)

    BTW:
    Es geht auch ohne diesen großen Beleuchter, wenn auch nicht nach köhlerscher Beleuchtung:
    [Blockierte Grafik: http://i556.photobucket.com/albums/ss3/mikroloewe/LED-Universal.jpg]

    VG
    Bernd

    • Offizieller Beitrag

    Hallo Adalbert,

    wenn ich am WE heimkann, sende ich dir eine Tabelle aus Bayer Riesenberg, worin alle Wendelgrößen drinnen stehen, welche Lampe was hat.
    Daran bitte die Auswahl der LED richten.

    Bernd, Universell und alles machbar ist mit dem Amplival bzw. Jenaval auch, von Zeiss (Jena) ;-), muss ich zu meiner Ehrrenrettung mal sagen ;) Aber du hast schon recht, vom Preis-Leistungsverhältnis udn den gebotenen Möglichkeiten udn Zusätzen ist ein Standard unschlagbar.

    lg
    Franz

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    Die Welt wäre so schön wenn Frauen so einfach gestrickt wie die Maxwellschen Gleichungen wären --
    Mann könnte dann Störfelder berechnen und Wellen, Phasen und Ströme ....
    und die Harmonischen ganz leicht checken..
    http://interphako.at

    Hallo Adalbert
    DurchlichtFlu haben wir in der Urzeit auch verwendet (60er) - das Problem waren va die "Steinzeitfilter" (BG3, BG12) die extrem flache Kanten haben.
    mit DF wars besser, aber ich kann mich erinnern, dass wir bei Anregung 410 mit K470...490 noch Hintergrund hatten, und mit BG12 (va 436er linie) noch bei K530.
    Der Ploem-Opak 1968 war dann ein großer Fortschritt, obwohl bei schwachen Vergrößerungen (4, 10, 16) unbrauchbar.
    Deswegen wurden Obj wie 10/045 und 5/025 gebaut. Das Fl40/1,3 war auch ein großer Fortschritt 1970.
    Die Filter sind heute auch wesentlich besser - innerhalb 20...25nm geblockt auf 10*-6...10*-8, dafür auch teuer (1,5...1,8k€ pro Filtersatz)
    Ob man mit solchen tollen Filtern heute auch wieder Durchlichtflu machen könnte, hätte mich sehr interessiert, es hat mich aber noch niemand die Filterblöcke zerlegen lassen (auch wenn sie auf meine Empfehlung angeschafft wurden).
    Das alles bezieht sich auf Immunflu mit kleinem "stokes shift". Mit Autoflu hab ich mich nicht beschäftigt, da könnte man durchaus mit "steinzeit"filtersätzen wie Zeiss09 gute Ergebnisse bekommen.
    Mit LEDs kenn ich mich auch nicht aus, da käme es auch aufs Kontinuum an, und wieviel 0,00x%

    Hallo Helmut -

    fairerweise muss man sagen, dass der Zeiss-Filtersatz 09 (und die anderen auch) sich im Laufe der Jahrzehnte doch geändert hat und er besteht nicht mehr aus BGs und Gelatine-Kantenfiltern. Bei mir sind das alles Band- oder Kantenfilter und die sind sicher auch schon > 20 Jahre alt.

    Viele Grüße

    Rolf

    • Offizieller Beitrag

    Hallo,

    es trifft schon zu, den Zeiss Filtersatz gibt es nun schon eine Weile und doch ist er immer noch aktuell und kann für die modernen Modelle erworben werden, allerdingt zu einem nicht ganz niedrigen Preis. Es handelt sich dabei auch nicht um einfache Farbgläser, sondern um bedampfte Interferenzfilter, die auch mit entsprechender Sorgfalt zu behandeln sind, insbesondere die Farbteiler für Auflicht-Fluoreszenz. Ein Tropfen falsches Lösemittel und schon ist die Bedampfung dahin und der Teilungseffekt ebenso.
    Da Adi aber nun scheinbar in den Anfängen steckt, wo schließlich jeder von uns mal war, habe ich zunächst auf die preiswerte Methode verwiesen, um die Fluoreszenz erstmal kennenzulernen. So hat man es schließlich in den 60ern bereits betrieben mit den schwarzen Diven und es funktioniert heute noch. :)

    Viele Grüße
    Bernd

    Ja, die Oberfläche von Interferenzfiltern sieht aus wie ein Spiegel - meist gelblich, rötlich, rosa, lila schimmernd und die Farbe im Durchlicht entspricht dann ungefähr der Komplementärfarbe diese Farbstichs.

    Gruß

    Rolf

    Hallo Rolf

    Zitat von ephestia

    Zeiss-Filtersatz 09 (und die anderen auch) sich im Laufe der Jahrzehnte doch geändert

    mein salopper Ausdruck "Steinzeit" hat sich auf die Bauart und nicht auf den Jahrgang bezogen. Den KP490 Filter gibts immerhin seit den 60er Jahren (Balzers)
    Solche Filtersätze (09 oä) haben alle Filterhersteller im Programm, einfach um auch etwas preiswertes anzubieten. Anbei Filterkurven, sollten self-explaining sein! Bei FITC ist zb die Effizienz von 09 40% emissionsseitig, im vgl dazu HQ-EGFP bei 83%!
    So lästigen Leuten wie mir bietet Zeiss seit über 15a nur mehr Chroma oder Semrock Filter an (http://www.ahf.de)
    Für Autofluoreszenz sind solche Überlegungen, wie schon oben gesagt, vollkommen irrelevant

    Zitat von Adalbert

    sensiblen Filter irgendwie einfach erkennen?

    die sind üblicherweise so verkittet, dass die Dielektrikschichten innen liegen, unverkittete hats nur bis anfang 70er gegeben
    Spiegel konnte ich mit Ether 1er Spritze und 0,4er Nadel putzenRG665.bmp

    Der Inhalt kann nicht angezeigt werden, da er nicht mehr verfügbar ist.
    RG665.bmp09.bmpEGFP.bmphqFITC.bmpLP570.bmpRG665.bmp09.bmpEGFP.bmphqFITC.bmpLP570.bmp

    Einmal editiert, zuletzt von elmilabor (28. März 2015 um 15:40)

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