Sind meine Filter für Fluoreszenzmikroskopie geeignet für mein Assay?

1. offizieller Beitrag

    Hallo Liebe Forums-Mitglieder und Experten,

    Ich arbeite gerade fleißig an meiner Masterarbeit und möchte dafür in Echtzeit cytotoxische Effekte auf verschiedene Zellkulturen testen.

    Dafür habe ich ein wunderbares Assay gefunden: Dual Apoptosis Assay with NucView 488 Caspase-3 Substrate and CF640R-Annexin V

    (Informationen dazu: https://biotium.com/product/dual-a…f594-annexin-v/)
    In der Product information steht zur Mikroskopie, dass man FITC und Texas-Red Filter braucht.
    Meine Hochschule hat ein Mikroskop welches folgendes detektieren kann:

    Excitation 460-490 und Emission 520
    Excitation 480-550 und Emission 590

    Damit müsste ich die Farben rot und grün doch visualisieren können, oder?

    Ich bin absoluter Neuling was Fluoreszenzmikroskopie bzw. das selbstständige Arbeiten und die Versuchsplanung angeht und wäre sehr dankbar,
    wenn mir jemand bei der Entscheidung, den Assay zu kaufen (400€) oder nicht, helfen könnte.

    Liebe Grüße
    Olga

    • Offizieller Beitrag

    Hallo Olga,

    zunächst einmal Willkommen im Forum! :)

    Der erstgenannte Filtersatz ist für Blauanregung, es werden dabei die Farben Rot, Gelb und Grün für die Beobachtung vom Sperrfilter durchgelassen.
    Der zweite Filtersatz ist jedoch für Grünanregung, d.h. die Farbe Grün wird für die Anregung benutzt und ist bei der Beobachtung nicht zu sehen, nur die Farbe Rot.

    VG
    Bernd

    Hallo Bernd,

    Vielen Dank für die schnelle Antwort!

    Also könnte ich mit dem ersten Filtersatz sowohl rot als auch grün beobachten-also genau die Farben die ich benötige.
    Dann stünde meinem Assay ja nichts im Wege, wenn ich das richtig verstanden habe.

    Grüße
    Olga

    • Offizieller Beitrag

    Hallo Olga,

    doch nicht dafür! :)

    Es kommt nun zunächst darauf an, auf welche Wellenlänge deine Probe reagieren soll. Je nach Farbstoff kann das Blau, Grün, aber auch Violett oder gar Ultraviolett (UV) sein. Das bestimmt der Erregerfilter des Filtersatzes. Bei FITC ist das Blauanregung und bei Texas-Red Grünanregung.
    Die Wellenlänge, welche beobachtet werden kann, ist grundsätzlich länger als die des Erregerlichtes. Ansonsten könnte man die Fluoreszenz nicht als solche erkennen. Und die Wellenlänge des Erregerlichtes wird somit durch die Filterzusammenstellung ausgeblendet.
    Blaues Licht hat eine kürzere Wellenlänge als grünes Licht, grünes Licht eine kürzere Wellenlänge als rotes Licht.
    Wenn man also mit grünem Licht erregt, wird man nur eine rote Emission beobachten können, sofern bei der Probe etwas fluoresziert.
    Kürzere Wellenlängen unter 590nm werden bei diesem Sperrfilter abgeblockt.
    Beim ersten Filtersatz werden die Wellenlängen unter 520nm abgeblockt, so daß die Farben Rot, Gelb und noch Grün beobachtet werden können.
    Aber nur, wenn in der Probe etwas enthalten ist, das auf die Blauanregung von 460-490nm reagiert.

    VG
    Bernd

    Hallo Olga,

    habe gerade erst das Datenblatt des Farbstoffs gesehen. Demnach müsste der zweite Filterblock funktionieren. Einfach mal testen!

    Trotzdem die Frage: welches Mikroskop? Ich habe eine ganze Reihe Filterblöcke, da könnte ich eventuell mal für einen Versuch aushelfen.

    Hallo Klaus,

    Wir haben ein CKX41-Mikroskop von Olympus.
    Das hier sind einige Daten, die ich dazu habe:

    In dem CKX-Fluoreszenzilluminator sind bereits Fluoreszenzfiltermodule für GFP und RFP mit folgenden Spezifikationen enthalten:
    GFP: Anregung: Bandpassfilter 460 - 490 nm, Dichroitischer
    Teilerspiegel: 500 nm, Emission: Langpassfilter: 520 nm
    RFP: Anregung: Bandpassfilter 480 - 550 nm, Dichroitischer
    Teilerspiegel: 570 nm, Emission: Langpassfilter: 590 nm

    Der einzige Farbstoff, den wir da haben ist Acridin Orange. Daher würde ich den Assay ohne vorheriges Ausprobieren mit den eigentlichen Farbstoffen bestellen. Da mein Budget allerdings sehr begrenzt ist, muss ich vorher möglichst sicher stellen, dass die Technik zumindest keine Probleme macht.

    Vielen Dank für die Hilfe
    Viele Grüße
    Olga

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