Fluoreszenzmikroskopie

  • Hallo Mario!

    Bei UV Durchlicht (Fluoreszenz) beleuchtest du wie bei "normalem" Durchlicht und die Fluoreszenz tritt überall auf, wo es physikalisch eben geht. Es überstrahlt anfänglich sehr und die Fluoreszenz kann schnell ausbleichen.

    Bei Auflicht Fluoreszenz fokusierst du mehr oder weniger gut in deiner Fokusebene, wodurch die Fluoreszenzabstrahlung vorwiegend aus dieser Ebene auftritt. Das Bild ist dadurch von Haus aus schärfer. Ganz gelingt es nicht, da natürlich auch das out of focus UV Licht zur Anregung führt. Es lässt sich aber durch Stacken und anschließender Dekonvolution (die Umkehroperation zur Konvolution = Unschärfe, Streuung, Beugung, ....) das "unverfälschte" Fluoreszenzbild errechnen. Für die Dekonvolution braucht man eine point spread function, die sich aus den optischen Eigenschaften des Mikroskops annähernd berechnen lässt oder man nimmt sie mit einem fluoreszierenden seeeehr kleinen Partikel auf. Ich mach meistens die erste Version. Ich hab im Forum ein paar Bilder Spirogyra, Spirogyra nur Chlorophyl, Closterium und Epithelzellen. Vor allem bei letzterem Bild hab ich noch ein wenig Text dabei im Thread.

    VG
    Klemens

  • Ach ja, zu beachten:

    • gute Filter verwenden und
    • eine starke Lichtquelle (ich nehme verschiedene 3 Watt LEDs im Bereich von 360 bis ~500 nm)
    • bei Chlorophyll brauchst du keinen Farbstoff, wenn es spezifischer wird, gibt es unzählige Farbstoff/Filter Kombinationen (sehr günstig bis extrem teuer)
    • sauber arbeiten beim Färben, sonst gibt es diffuse Fluoreszenzen
    • eine lichtstarke Kamera, damit du nicht unnötig lang draufbraten musst (bleaching)

    VG
    Klemens

  • Das kommt auf das Anregungslicht an. Im nahen UV bzw. violett funktionieren die meisten normalen Objektive noch gut. Das Anregungslicht muss ja durch das Objektiv auf das Objekt und das Fluoreszenzlicht zurück durch's Objektiv in Richtung Auge oder Kamera. Bei echtem UV hast du schon eine deutliche Schwächung, funktioniert aber auch noch. Wichtig ist, dass die Auflichteinrichtung mit guten, sauberen Filtern ausgestattet ist. Sie verzeihen keine Fingerabdrücke oder gar Putzen mit Lösungsmittel. Da sind sie gleich kaputt oder es kommt nur mehr ein sehr flaues Bild zustande.

    Bernd (Nomarski) hat eine Zusammenstellung von Filtersätzen hier hereingestellt. Und hier geht's zum Filterassistent von Zeiss.

    VG
    Klemens

  • bei Auflicht-Fluoreszenz was brauch ich da für Objektive?

    Hallo Mario,

    wenn du mit bedeckten Präparaten arbeitest natürlich normale DG-korrigierte Objektive. Bei Leitz und Olympus kenne ich spezielle für UV.
    Bei unbedeckten Präparaten natürlich solche für Auflicht, die sind normalerweise immer ohne DG gerechnet. Merke: möglichst hohe Apertur, damit ordentlich Licht durch kommt!

    • Offizieller Beitrag

    Hallo Mario,

    noch ein zusätzlicher Hinweis:
    Für die normalen Zwecke sind die Kollektorlinsen zur besseren und homogenderen Ausleuchtungen teilweise mattiert. Viele Lampenhäuser haben dazu eine Streuscheibe, die man wegklappen kann. Bei der Fluoreszenzanregung bedeutet das aber wieder ein gewisser Lichtverlust, damit auch Energieverlust für die Anregung, so daß ein Kollektor ohne mattierte Linsen grundsätzlich vorteilhafter ist. Bei den Lampenhäusern mit Streuscheibe hat man es dagegen einfach, indem man sie nur wegklappen braucht.

    VG
    Bernd

  • Hallo Mario,
    vielleicht steht es ja in einem anderen Beitrag von dir, aber du brauchst einen Auflichtkondensor in dem die Fluoreszenz-Filterblöcke sitzen.

    Natürlich kann man auch von der Seite her mit einer blauen LED schräg auf die Probe leuchten und dann einen LP-Filter (500 bis 530 nm) als Sperrfilter irgendwo im Beobachtungsstrahlengang platzieren. Damit kann man Wackerfärbungen anschauen oder Chlorophyll. Das ist nicht ganz toll funktioniert aber schon.

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