Beiträge von kljosc

    Du könntest mit Image processing noch etwas rausholen aus den Fluoreszenzaufnahmen. Entweder klassische Deconvolution oder mit Deep learning

    kljosc
    29. Oktober 2020 um 23:32

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    VG
    Klemens

    Was noch in der flatfield correction Software Aufzählung fehlt sind imageJ (Fiji) und ICY. Open source image processing Software mit einer Riesen Community aus der akademischen und industriellen Welt. Siehe auch

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    und

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    VG
    Klemens

    Also wenn du was von der freien Base bekommst, wäre ich für ein paar Gramm dankbar. Damit lassen sich Tümpelbewohner besser einfärben ohne sie gleich zu töten. Das Zinksalz ist letal schon bei geringer Konzentration. Mit dem Hydrochlorid Hydrat hab ich keine Erfahrung, dürfte aber ebenso viel weniger toxisch für Microorganismen sein als das Zinksalz und trotzdem etwas wasserlöslich. Auch für das Hydrochlorid hätte ich Verwendung ;)

    Vor dem GHS H341 Suspected of causing genetic defects muss man bei sauberer Arbeit keine Angst haben, macht aber den Zugang zu der Substanz als Privatperson seeehr schwer, selbst als Chemiker.

    Auf der Canon stell ich eine fixe Zeit ein, bei der DigiRetina in der Software. Meist mache ich eine Reihe mit verschiedenen Belichtungszeiten bis ein ordentliches Bild entsteht, dann mit dieser Belichtungszeit einen Stack. Es hängt stark von der Intensität der Fluoreszenz ab, die die eigentliche Lichtquelle im Bild ist im Gegensatz zu Durch- oder Auflicht.

    Daniel falls du Acridinorange hast, gib mal eine kleine Menge (0,01%ige wässrige Lösung) dazu, ein wenig warten und du kannst evtl. die Zellkerne sehen. Musst du probieren. Es färbt DNA (Anregung 502, Fluoreszenz 526 nm grün) und RNA (Anregung 460, Fluoreszenz 650 nm rot)

    Nachträgliches Filtern kann etwas helfen Strukturen besser darzustellen. Wirklich besser wird es aber mit Deconvolution (eine mathematische Faltungsoperation), bei der man aber idealerweise eine selbst gemessene oder gerechnete point spread function (PSF) verwendet. Es gibt auch die sogenannte blind deconvolution ohne PSF. Der Rechenaufwand ist aber enorm (auf meinem PC Stunden).
    Mittlerweile geht es aber auch schon ganz brauchbar mit KI (auf meinem PC mehrere Minuten).

    "Extrem lange Belichtungszeit" ist bei meinen Aufnahmen im Sekundenbereich.

    Ja, mit Photoshop (auch ImageJ oder Icy) kann man eine nachträgliche Bandpassfilterung machen. Eine echte "hardwaremäßige" Filterung wie im kontinuierlichen Spektrumsbereich der Fluoreszenz gewünscht, bekommst du dadurch nicht (sRGB Raum oder was die Kamera eben kann).

    Gute Fotos gelingen immer nur mit dem "richtigen" Licht, dh. am "Rückweg" Anregungswellenlängen sperren und Fluoreszenzwellenlängen durchlassen. Die Fluoreszenz ist wesentlich schwächer als die Anregung und wird von dieser hoffnungslos überstrahlt. Den Dynamikbereich schafft die beste Kamera nicht und es bleibt nix mehr zum softwaremäßigen Filtern über. Man kann so auch mit geringerer Anregungsintensität anfangen und das Bleaching verringern. Das setzt gute Filterung voraus und einen abgedunkelten Raum. Die Kamera soll dann nur die Photonen abbekommen, die das Fluoreszenzbild ausmachen. Da kann man mit langen Belichtungszeiten kumulativ noch viel mehr einfangen, als das Auge sieht. Also alles entfernen, was nachher nicht auf dem Bild erscheinen soll, dann klappt es auch mit einfacherer Hobbyausrüstung.

    Hi Daniel,

    Bernd hat da einige Bilder im Forum als Anregung für den Bau. Wie gesagt, meine 2nd generation LED Beleuchtungen sehen sehr ähnlich aus. Die erste Version sah noch so aus Meine Version der LED-Beleuchtung für ein Zeiss Standard 16
    Wichtig sind vor allem bei den stärkeren LED die Kühlung und die Konstantstromversorgung. Zu viel Strom nehmen sie übel und sterben spontan. Daher im Datenblatt nachsehen, was man ihnen zumuten kann.

    Das ist ein Nachfolgemodell Zeiss Standard mit Epi Fluoreszenz, leider noch unvollständig

    VG, Klemens

    Hi Daniel,

    ich hab auch einiges mit Fluoreszenz herumprobiert. Genau wie Bernd nehme ich (selbst gebaute) LED-Beleuchtung verschiedener Wellenlänge. Zum Färben geht meist Acridinorange sehr gut, aber es gibt noch zig andere Farbstoffe mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen. Ein dankbares Präparat sind Epithelzellen aus dem Mund (Abstrich der Wange) mit sehr verdünnter Acridinorange Lösung gefärbt, blau anregen und die größeren Wellenlänge durchlassen (verschiedene Fluoreszenzwellenlängen). Wichtig bei schwacher Fluoreszenz ist längere Belichtung und abgedunkelter Raum. Die Fluoreszenz nimmt bei längerer Anregung jedoch meistens ab (bleaching).

    Spirogyra

    ohne Färbung, nur Chlorophyll
    Closterium

    VG
    Klemens

    Ultraschall ist nicht aufwändig. Bei mir steht das Gerät fix in der Waschküche neben dem Waschbecken. Wenn wieder ein paar Teile zur Reinigung zusammen gekommen sind, schalte ich ein. Danach mit Aqua Dest. spülen und trocknen.

    Also ich reinige sie im Ultraschallbad, so wie sehr viele andere Dinge auch. Die kosten auch in der Edelstahlausführung (Made in China) nicht wirklich viel. Meist reicht heißes Wasser mit einem Spritzer Klarspüler. Für hartnäckige Verschmutzungen schwöre ich auf Tickopur R 33 oder TR 13 Intensiv Reiniger.

    Anschließend mit Aqua Dest. spülen und trocknen.

    VG

    Klemens